- الکل بطور کامل از لوله ها خارج می گردد و به میزان ۵۰ میکرولیتر آب مقطر و یا TE اضافه می گردد.
- درجه خلوص و میزان DNA استخراج شده با بهره گرفتن از دستگاه بیوفوتومتر (….) اندازه گیری می شود و DNA در روی ژل اگارز ۵/۱ درصد الکتروفورز و مشاهده می گردد.
شکل۳- ۹ : مراحل استخراج DNA
الکتروفورز نمونه های DNA:
مواد و وسایل لازم:
آگارز (Merck)
بافر الکتروفورز TAE
بافر بار گذاری ( حاوی ۲۵/۰ درصد بروموفنل بلو و ۴۰ درصد ساکارز در آب)
اتیدیوم بروماید(Merck)
منبع الکتریکی الکتروفورزPower supply
تانک الکتروفورز افقی
قاب، شانه ها و گیره های مناسب الکتروفورز
دستگاه Gel documentation و پرینتر مخصوص
ترازوی دیجیتالی ( Sartorius )
ارلن
استوانه مدرج
سمپلر و سر سمپلر ها مناسب
مارکر وزن مولکولی
تهیه بافر TAE 50X :
Tris 124 gr
EDTA 18.6 gr
Acetic acid glacial 28.5 ml
Distilled Water up to 500 ml
pH این محلول درحدود ۵/۸ تنظیم می شود و در هنگام کار برای تهیه آگارز و بافر تانک به ۱X رسانده شد. برای تهیه ژل الکتروفورز به نسبت ۲-۱ درصد از آگارز در بافر TAE 1X تحت حرارت جوش حل می شود و پس از آنکه دمای آن به ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتی گراد رسید( تا حدی که بخار از آن متصاعد نشود) یک تا ۲ میکرولیتر اتیدیوم بروماید (mgml^-1 ۱۰) به آن اضافه می شود و در قالب مناسب پخش می شود و پس از بسته شدن اگارز مورد استفاده قرار می گیرد. سپس ۵ میکرولیتر از DNA استخراج شده با ۳ میکرولیتر آب مقطر و ۲ میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شده و به درون چاهک های ژل منتقل ( Load ) می شود و جریان الکتریکی با ولتاژ مناسب به اندازه ۱ تا ۵ ولت به ازای هر سانتی متر مکعب فاصله آند تا کاتد (۸۰ تا ۱۰۰ ولت) بر قرار گردید.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

سپس در دستگاه ترانس لومیناتور مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل – ۱۰ ).
شکل۳– ۱۰ : الکتروفورز DNA استخراج شده از گونه های کاندیدا و بررسی کیفیت آن در بیمارن مورد مطالعه، DNA استخراج شده کمی بعد از محل نمونه گذاری مشخص است، اگر نمونه حاوی RNA باشد با سرعت بیشتر حرکت می کند و در ۳ باند تشکیل می شود که در برخی از نمونه های زیر بوضوح مشخص است و برای انجام آزمایشات بعدی نیاز به RNase برای ازبین بردن آن است. پروتئین های اضافی نیز در محل نمونه گیری باقی می مانند.
۳-۲-۵) تهیه سوسپانسیون سلول مخمری کاندیدا آلبیکنس:
پس از انجام روش های تعیین هویت کاندیدا ومشخص شدن کاندیدا آلبیکنس در هر ۲۰ نمونه به دست آمده این نمونه ها را بر روی محیط کشت سابورو دکستروز آگار به روش خطی در کنار شعله کشت داده و در گرم خانه در دمای۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۷۲-۴۸ ساعت نگهداری شد و پس از رشد مخمر های کاندیدا آلبیکنس از آن سوسپانسیونی مخمری تهیه گردید.
بدین ترتیب که ابتدا میزان بسیار کمی از یکی از کلنی های مخمری در کنار شعله برداشته و در سرم فیزیولوژیک به حالت سوسپانسیون در آورده شدند سپس ۱۰ میکرولیتر از سوسپانسیون حاصل توسط سمپلر استریل برداشته و با بهره گرفتن از لام های شیشه ای نئوبار با درشت نمایی ۴۰ میکروسکوپ و۳ بار تکرار مورد شمارش قرار گرفته و میانگین کلنی ها محاسبه گردید. از سوسپانسیون سلولی با تراکم ۱۰×۱سلول در هر میلی لیتر تهیه شد. این عمل برای هر ۲۰ نمونه انجام شد.
۳-۲-۶ ) روش میکرودیلوسین :
برای انجام آن از میکروپلیت های ۹۶ خانه ای استریل ساخت کشور سوئیس ( شکل – ۱۱ ) و هم چنین از سمپلر و سر سمپلرهای آبی و زرد استفاده گردید.
در ابتدا با بهره گرفتن از سمپلر و سر سمپلرهای آبی استریل، به تمامی حفرات میکروپلیت ۱۰۰ میکرولیتر محیط کشت آر- پی- ام- آی ۱۶۴۰ ریخته شد.
این عمل به این صورت بوده که توسط سمپلر و سر سمپلرهای آبی استریل ۱۰۰ میکرولیتر فلوکونازول به حفره اول اضافه شد. پس از مخلوط شدن محیط و دارو مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از حفره اول به حفره دوم ریخته شد و پس از مخلوط شدن آنها، ۱۰۰ میکرولیتر به حفره سوم اضافه شد و به همین ترتیب تا آخر ۱۰۰ میکرولیتر بیرون ریخته شد.
در مرحله بعد به هر یک از حفرات یک ردیف توسط سمپلر و سر سمپلرهای زرد استریل ۱۰ میکرولیتر از سوسپانسیون قارچ مشخص ( شماره گذاری شده ) اضافه شد. به طوری که هر ردیف متعلق به سوسپانسیون قارچ خاصی بود. هم چنین، از حفره های میکروپلیت، یک حفره از هر ردیف به عنوان کنترل مثبت برای هر کدام از گونه های قارچی کاندیدا آلبیکنس مورد آزمایش و یک حفره به عنوان کنترل منفی، برای داروی تحت آزمایش در نظر گرفته شد. به طور معمول، محلول استاندارد در برابر اولین غلظت مورد آزمایش فلوکونازول ( میکروگرم در میلی لیتر ) ساخته می شدند. آزمایشات ۴ مرتبه تکرار می شد و نتایج MIC90 و MFC ثبت می گردیدند. ( شکل – ۱۲ )
شکل ۳– ۱۱ : پر کردن حفره های میکروپلیت توسط سمپلر و سر سمپلر در روش میکرودیلوسین
۳-۲-۷ ) موارد کنترل مثبت و کنترل منفی آزمایشات :
یک حفره از حفرات در ردیف میکروپلیت، به عنوان کنترل مثبت برای قارچ کاندیدا آلبیکنس مشخص شده در نظر گرفته شد که حاوی ارگانیسم مذکور و محیط کشت آر- پی- ام- آی ۱۶۴۰ بود.
هم چنین یک حفره از حفرات هر ردیف میکروپلیت، به عنوان کنترل منفی برای قارچ کاندیدا آلبیکنس مشخص شده در نظر گرفته شد که حاوی فلوکونازول مورد آزمایش و محیط کشت آر- پی- ام- آی ۱۶۴۰ بود.
۳-۲-۸ ) انتقال میکروپلیت ها به گرم خانه ( گرم خانه گذاری ) :
در این مرحله اطراف درب میکروپلیت ۹۶ خانه ای را با بهره گرفتن از چسب اسکاج محکم نموده و به مدت ۴۸ ساعت در گرم خانه ۳۳ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. تا پس از مدت مذکور بر اساس کشت مجدد هر کدام از حفرات میکروپلیت در مورد آنها قضاوت انجام شود و MIC90 و MFC فلوکونازول مشخص گردد.
۳-۲-۹ ) کشت مجدد محتویات هر یک از حفرات میکروپلیت روی محیط سابورو دکستروز آگار حاوی کلرامفنیکل ( SC ) :
پس از ۴۸ ساعت هر یک از حفرات میکروپلیت حاوی محیط کشت آر- پی- ام- آی ۱۶۴۰ فلوکونازول و ارگانیسم مورد نظر ( کاندیدا آلبیکنس ) و هم چنین از حفرات کنترل مثبت و منفی به مقدار ۱۰ میکرولیتر برای کشت روی پلیت حاوی محیط سابورو دکستروز آگار حاوی کلرامفنیکل ( sc ) و به وسیله سمپلر برداشت می شد. به منظور اختلاط کامل و یکسان محتویات میکروپلیت ها، هنگام برداشت از حفرات میکروپلیت، ابتدا با سر سمپلر محتویات آن را به خوبی و به صورت دورانی مخلوط کرده و نیز هنگام برداشت با سر سمپلر چند بار آن را پر و خالی نموده و سپس روی پلیت حاوی محیط sc کشت داده می شد. ( شکل – ۱۳ )
لازم به ذکر است، این کار در زیر حود، کنار شعله و با وسایل استریل انجام می شد. به منظور پخش نمونه روی محیط sc ، پلیت حاوی محیط کشت چندین بار به طور افقی حرکت داده می شد. پس از آنکه اطراف پلیت های محیط کشت sc با چسب اسکاج بسته می شد، آنها به انکوباتور ۳۳ درجه سانتی گراد منتقل می شدند و پس از ۴۸ ساعت مورد بازخوانی قرار می گرفتند و بر اساس درجه رشد قارچ بر روی آنها، MIC90 و MFC ثبت می شد. ( شکل – ۱۴ )
شکل۳ – ۱۲ : رشد کاندیدا آلبیکنس روی محیط SC بعد از برداشت از حفرات میکروپلیت
MIC در پلیت های حاصل از کشت، پلیتی است که کاهش رشد قارچ در مقایسه با پلیت شاهد مثبت، مشهود است. MIC90 در پلیت های حاصل از کشت، پلیتی است که کاهش ۹۰ درصدی رشد قارچ در مقایسه با پلیت شاهد مثبت مشهود است.
MFC پلیتی است که عدم رشد قارچ در آن و در مقایسه با پلیت شاهد مثبت، مشهود است.
در این تحقیق ، MIC تعیین شده ، MIC90 می باشد ( در صورتی که در رقت های پایین تر دارو نیز رشد قارچ، در مقایسه با شاهد، کاهش یافته بود ) ولی آنچه به عنوان MIC ، ثبت شده است، پلیتی است که کاهش ۹۰ درصدی رشد را در مقایسه با پلیت شاهد مثبت، نشان داده است.
شکل۳ - ۱۳ : روش میکرودایلوشن در پلیت ۹۶ خانه ای
شکل۳ - ۱۴ : نحوه قرائت نتایج در کشت مجدد از خانه های تلقیح شده
فصل چهارم
نتایج
۴-۱ ) نتایج حاصل از شناسایی کاندیدا آلبیکنس توسط روش PCR-RFLP :
طبق شکل ۴-۱ یافته های پژوهش نشان می دهد در الکتروفورز DNA حاصل از PCR تمام نمونه های مورد مطالعه از مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی، کاندیدا آلبیکنس می باشند.
شکل ۴-۱ : الکتروفورز DNA استخراج شده از گونه های کاندیدا