فایکول

۲۵g

برموفنل بلو

۰٫۰۵g

گزیلن سیانول

۰٫۰۵g

پودر آگارز (LE)
۳-۴-۶-۱-۲ روش کار
بعد از اتمام PCR برای تشخیص محصول تکثیر شده از ژل آگارز ۲ درصد استفاده می شود. برای تهیه ژل، ابتدا میزان لازم آگارز را وزن کرده (براساس حجم نهایی) و در مقدار مناسب بافر TAE X1 ریخته و با حرارت غیر مستقیم می جوشانیم تا کاملاً حل و شفاف شود. بعد از خنک شدن ژل تا دمای حدود ۶۰ درجه به طوری که بخار از آن متصاعد نگردد و قبل از سرد شدن و بستن ژل، آن را در قالب مخصوص ژل که شانه ایجاد چاهک در آن قرار داده شده، می ریزیم. پس از بستن ژل شانه را بیرون آورده و ژل را در تانک الکتروفورز حاوی بافر TAE X 1 می گذاریم.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

پس از تهیه ژل به هر یک از میکروتیوب های حاوی محصول PCR 2 میکرولیتر بافر بارگذاری سایبر گرین اضافه و به آرامی مخلوط می کنیم.
سایبرگرین نوعی بافر رنگ آمیزی DNA با حساسیت بالاست که به آسانی قابل استفاده است. با توجه به ایمنی بالای آن جایگزینی است برای رنگ جهش زای اتیدیوم بروماید. اساس کار این رنگ بر اتصال به دو رشته ی DNA استوار است. کمپلکس DNA و رنگ، نور آبی را با طول موج ۴۸۸ nm جذب می کند و نور سبز با طول موج ۵۲۲ nm ساتع می کند.
سپس با دقت نمونه ها را به ترتیب مشخص به چاهک های ژل در قطب منفی انتقال داده می شود. در کنار محصولات PCR در یکی از چاهک ها، مارکر تعیین اندازه مولکولی DNA ریخته می شود. پس از انتقال نمونه ها بر روی ژل، الکتروفورز با ولتاژ ۱۰۰ ولت انجام می شود. پس از اتمام الکتروفورز، با تاباندن نور ماوراء بنفش توسط دستگاه های Transluminator باندها قابل مشاهده شده و تفسیر می گردند. همزمان می توان از ژل بر روی دستگاه به وسیله دوربین پولاروید مخصوص عکس تهیه کرد.
بعد از اطمینان از مناسب بودن محصولات PCR برای sequencing، آنها در هر دو جهت forward و reverse تعیین توالی شدند.
۳-۴-۶-۲ توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر
از میان هفت ژن مورد بررسی، سه ژن از طریق روش توالی یابی هدف دار^[۶۵] (OtoSCOPE sequencing) بررس شدند و چهار ژن از روش توالی یابی سنگر. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر اگزون های ژن GJB4,GJC3, SLITRK6, NESP4 در جدول زیر آمده است.
جدول ۳-۱۵ توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر اگزون های ژن GJB4, GJC3,SLITRK6, NESP4

Reverse

Forward

Exon

GENE

GTAGAAGACTTCACTGAGGTTGAG

GTATAGACCTTCCACGTGCAG

Exon 2.1

GJB4

TTGCCATATACAAAATCCCCAGTAG

CTCTACAAGGATTATGACATGCCC

Exon 2.2