۲-۲۵-۱- مراحل کلون کردن ژن

۱- جدا کردن قطعه ای از یک منبع DNA حامل ژنی که باید کلون شود.
۲- اتصال قطعه مورد نظر به حامل یا وکتو، تا یک مولکول نوترکیب DNA یا یک کایمر ایجاد شود.
۳- ترانسفورماسیون DNA نوترکیب به باکتری یا میزبان مورد نظرکه حامل درون سلول میزبان تکثیر یافته وهم از خود و هم ژنی که حمل می کند نسخه های متعدد تولید می کند.
۴- شناسایی و جداسازی کلونی های حاصل از باکتری که حامل ژن مورد نظر می باشند(غربالگری) (۲۰۸).

۲-۲۵-۲- میزبان کلونینگ

از جمله میزبان ها می توان به pET، سویه های E.coli k12،JM109وDH5α اشاره کرد.این میزبان ها دارای recA- و recA+ می باشند(فاقد ژن سازنده آنزیم اندونوکلئاز A و ژن سازنده آنزیم نوترکیبی). از طرفی این میزبان ها فاقد ژن RNA T7 پلیمراز(RNA پلیمرازی که به پروموتورT7 متصل و نسخه برداری نماید)هستند.این میزبان ها کارایی زیادی در انتقال پلاسمید دارند (۲۰۹).

۲-۲۶- آنزیم های محدود کننده

اغلب این آنزیم ها توالی های ۴ یا ۶ نوکلئوتیدی قرینه که اصطلاحا پالیندروم نامیده می شوند را شناسایی می کنند.
برای کلونینگ ژن، باید وکتور و DNA مورد نظر که توالی هدف را دارد به قطعات مجزا بریده شوند. که اندونوکلئازهای محدودکننده جهت برش در ناحیه خاصی از DNA در بیوتکنولوژی مولکولی کاربرد دارند که دو نوع برش را می‌توانند ایجاد کنند:

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱- برش با ایجاد انتهای چسبنده
۲- برش با ایجاد انتهای صاف (۲۱۰).

۲-۲۶-۱-آنزیم لیگاز

این آنزیم باعث اتصال قطعات DNA و پلاسمید مکمل می شود. این آنزیم برای اولین بار از باکتریوفاژ T4 جداشد. این آنزیم یک باند شیمیایی جدید بین گروه هیدروکسی کربن ۳ یک مولکول داکسی ریبوز با گروه فسفات کربن ۵ مولکول داکسی ریبوز بعدی برقرار می کندکه به نام باند فسفودی استری معروف است. این آنزیم همچنین دو انتهای صاف را هنگامی که در مجاورت آنزیم در تماس با هم قرار می گیرندبه هم متصل می کند (۲۱۱).

۲-۲۷- حامل های کلونینگ

یک حامل کلونینگ باید دارای یک منطقه همانندسازی باشد، تا قادر به تولید تعداد نسخه های زیاد از ملکول DNA نوترکیب درسلول میزبان باشد. همچنین بایدیک یا چند ژن شناساگرداشته باشد. این زن ها که باعث ایجاد مقاومت به بعضی از آنتی بیوتیک ها در سلول میزبان می شوند یک عامل شناسایی برای ملکول های نوترکیب به حساب می ایند. حامل کلونینگ محل های برش منفرد برای این آنزیم ها را دارد که به آن محل کلونینگ یا پلی لینکر گویند. حامل باید نسبتا کوچک باشد، چون ملکول های بزرگ در حین خالص سازی شکسته می شوند و از طرفی ملکول‌های کوچکتر راحت تر توسط میزبان جذب می شوند. از انواع حامل ها می توان به پلاسمیدها باکتریوفاژها، کاسمیدها، حامل های یوکاریوتی و کروموزوم های مصنوعی اشاره کرد(۲۰۸). هر ترادفی از DNA را می توان با درج آن در ناقلی مانند پلاسمید یا فاژ که توانایی تکثیر در باکتری ها را داشته باشد، کلون نمود. که در نتیجه کلون کردن مقادیر زیادی از یک ملکول اولیه تولید می شود. اگر ناقل بیانی باشد، علاوه بر تکثیر ژن مورد نظر قادر به بیان ژن موردنظر نیز می باشد (۲۰۸).

۲-۲۸-غربالگری وجود ژن

پس از مرحله ترانسفورماسیون ضروری است که با ساده ترین روش ممکن سلول هایی که ساختار صحیح را دریافت کرده اند شناسایی شوند. این شناسایی در دو مرحله انجام می شود. ابتدا سلول های حاصل از ترانسفورماسیون بر روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین کشت داده می‌شوند. فقط سلول‌هایی که حاوی پلاسمید هستند در این شرایط رشد خواهند کرد. سلول‌های ترانسفورم نشده به آمپی سیلین حساس بوده از بین خواهند رفت. در مرحله بعدی سلول‌های رشد یافته جهت وجود ژن مورد نظر ارزیابی می شوند (۲۰۸).

۲-۲۹-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی

مهمترین نکته در تولید پروتئین نوترکیب انتخاب میزبان می باشد که این انتخاب در تولیدوتخلیص پروتئین نوترکیب وکیفیت محصول اثر دارد. برای انتخاب سیستم بیان کننده مناسب برای تولید یک پروتئین نوترکیب، باید عواملی مانند نوع میزبان، شرایط رشد سلول، میزان سطح بیان و همچنین لزوم استفاده از یک سیستم دقیق کنترل کننده بیان را مورد توجه قرار داد (۲۱۲).
امروزه از سیستم های بیان کننده متعددی برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود که در دو گروه عمده سیستم های پروکاریوت نظیر اشرشیاکلی،باسیلوس سوبتلیس و…وسیستم های یوکاریوتی مانند مخمرها، قارچ ها، حشرات وسلول های پستانداران تقسیم می شوند(۲۱۳).
سیستم بیان کننده اشرشیاکلی متداول ترین میزبانی است که برای بیان پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا که از طرفی شاخص های مثبت یک باکتری از جمله توانایی رشد و تکثیر سریع، تراکم بالا در محیط های ساده و ارزان، مصرف کم مواد اولیه، کنترل آسان، میزان بیان بالای پروتئین نوترکیب و قدرت بالای پذیرش ژنهای بیگانه را دارد و از طرف دیگر وجود دانش فراوان در مورد ویژگی های ژنتیکی و بیولوژی مولکولی و در دسترس بودن تعداد زیادی از ناقل‌های تجاری کلون سازی آن را به موجود بسیار کارامدی برای تحقیقات مهندسی ژنتیک تبدیل کرده است (۲۱۳).
علی رغم مزایای سیستم بیان کننده اشرشیاکلی،هر ژنی قابلیت بیان در این میکروارگانیسم را ندارد و این امر ممکن است به علت تفاوت اصلی بین کدون های ژن بیگانه با کدون های معمول در ژن‌های اشرشیاکلی و همچنین وجود توالی اینترون باشد که سبب مشکل در ترجمه ژن و میزان محصول می گردد. فاز دیگر دلایل ناکارایی این میزبان برای بیان برخی ژن ها می تواند ماهیت ساختاری منحصر به فرد و دقیق ترادف ژنی، پایداری و کارایی ترجمهmRNA، نحوه شکل یابی پروتئین، تجزیه و تخریب پروتئین توسط پروتئاز های سلول میزبان و سمیت بالقوه پروتئین برای میزبان باشد (۲۱۳).
به طور کلی معایب اصلی اشرشیاکلی به عنوان یک سیستم بیان کننده را می توان در موارد زیر خلاصه نمود:
۱- عدم توانایی انجام بسیاری از تغییرات پس از ترجمه (مانند گلیکوزیلاسیون) که در سلول های یوکاریوتی مشاهده می شوند.
۲- فقدان مکانیسم ترشحی موثر پروتئین نوترکیب به محیط کشت.
۳- قابلیت محدود تشکیل پیوندهای دی سولفیدی.
طراحی مناسب سیستم های بیان کننده، قادر به حذف بسیاری از این محدودیت ها می باشد. امروزه گونه های تجاری اشرشیاکلی در دسترس هستند که این معایب را ندارند.(۲۱۴).

۲-۳۰-وکتورهای بیان کننده

تمام وکتورهای بیان کننده باید دارای ویژگی هایی از قبیل پروموتر مناسب، عوامل تنظیمی برای کنترل نسخه برداری و ترجمه، جایگاه های آنزیمی مناسب برای وارد نمودن DNA ژن مورد نظر، ناحیه پایان نسخه برداری(Terminator)، مارکر شناساگر برای تشخیص سلول های حاوی وکتور(اکثرا ژن مقاومت به آنتی بیوتیک) باشند. بسیاری از وکتورهای بیان کننده دارای عناصری علاوه بر موارد فوق هستند، به طوری که برخی از آنها دارای توالی نشانه به منظور ترشح یا هدایت اجزای اصلی یک پروتئین به فضای خاصی مانند پری پلاسم می باشند و در ساختمان برخی از آنها دنباله یا برچسب های (Tag) خاصی برای سهولت در فرایند تخلیص پروتئین و نیز آشکار سازی پروتئین نوترکیب استفاده می گردد. این برچسب ها گاه باعث افزایش حلالیت پروتئینمی گردند (۲۱۵).

۲-۳۰-۱- وکتورهای بیان کننده سیستمpET

سیستم pET از قوی ترین سیستم هایی است که تا کنون برای کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب در E.coli توسعه یافته است.ژن های کلون شده در سیستم pET تحت کنترل شدید پروموتر T7 باکتریوفاژ نسخه برداری و ترجمه می شوندو بیان آنها با فراهم آمدن یک منبع از RNA T7 پلیمراز در سلول میزبان تحریک می شود.پروتئین تولید شده در عرض کمتر از دو ساعت بعد از تحریک به بیش از ۵۰ درصد کل پروتئین های سلول می رسد. با وجود اینکه این سیستم فوق العاده قوی است اما امکان کاهش سطح بیان ژن با کاهش غلظت محرک بسادگی میسر است. کاهش سطح بیان ژن ممکن است بازده حلالیت تعدادی از پروتئین های مورد نظر را افزایش دهد (۲۰۹). از جمله فواید دیگر این سیستم توانایی نگهداری ژن های مورد نظر به صورت نسخه های خاموش در مرحله عدم تحریک است. هم اکنون بیش از ۴۲ نوع وکتور pET وجود دارد که هرکدام از آنها دارای ویژگی های خاصی می باشند. به جز سری pET-5 بقیه وکتورهای pET دارای کدون توقف در انتهای ناحیه کلونینگ و مناطق دنباله دار و T7 ترمیناتور هستند. شناساگرهای انتخابی این سری وکتورها آمپی سیلین و کانامایسین می باشد. وکتورهای هر سری با حروف از یکدیگر متمایز شده اند. به عنوان مثال pET-28a(+) که bp 5369 (جفت باز) طول دارد، دارای پروتئین اتصالی His می باشدکه در خالص سازی تمایلی کاربرد دارد. این دنباله فعالیت بیولوژیکی پروتئین را بوسیله تاثیر روی حلالیت آن در سیتوپلاسم یا صدور پروتئین به پری پلاسم افزایش می‌دهد و استفاده آن برای پروتئین هایی می باشد که ابتدا به صورت اجسام توده ای بیان می‌شوند. در طی خالص سازی در اثر شرایط کاملا دناتوره کننده، پروتئین به صورت محلول در می آید. تشکیل اجسام توده ای مزیتی برای خالص سازی محسوب می شود، به این دلیل که این اجسام به آسانی در اثر سانتریفوژ جدا می شوندو پروتئین در غلظت بالا به دست می آید. همچنین باعث محافظت پروتئین در برابر هضم پروتئولیتیک می شوند و اگر پروتئین سمی باشد، در حالتی که به صورت توده ای هستند، قادر به محدود کردن رشد سلولی نمی باشد. سیستمpET همچنین دارای دو نوع پروموتر است:T7 پروموتر و T7Lac پروموتر.T7Lac پروموتر محتوی ۲۵ جفت باز توالی Lac اپراتور است که بلافاصله در قسمت پایین دست منطقه ۱۷ جفت باز پروموتر قرار گرفته است. اتصال Lac رپرسور در این محل بطور موثری نسخه برداری از ژن توسط RNA T7 پلیمراز را کاهش می‌دهد (۲۰۹).

۲-۳۱-وکتورهای پلاسمیدی

پلاسمیدها، مولکول های DNA حلقوی دو رشته ای هستند که قادر به همانندسازی می باشند و در باکتری ها به صورت بخش های خارج کروموزومی مستقل حفظ می شوند. پلاسمیدها به عنوان عناصر ژنتیکی قابل همانندسازی و مستقل دارای خصوصیاتی هستند که آنها را وکتورهای بالقوه ای برای حمل DNA کلون شده ساخته است (۲۰۸). یک ناقل پلاسمیدی مطلوب برای کلونینگ دارای خصوصیات زیر می باشد:
- وزن مولکولی پایین
- توانایی ایجاد فنوتیپ مورد نظر در سلول میزبان
- جایگاه منحصر به فرد برای تعداد زیادی از آنزیم های محدودالاثر(۲۰۸)
- مارکر انتخابی(غالبا ژن مقاومت به یک آنتی بیوتیک است)
از طریق این مارکر، با افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت می توان سلول های فاقد ژن نوترکیب را از بین برد که این امر همچنین غربالگری کلنی های حاوی پلاسمید نوترکیب را نیز آسان می کند.
- مبدا همانندسازی(Origin)
مبدا همانندسازی پلاسمید عامل همانندسازی خود به خود و مستقل از کروموزوم می باشد.
- پروموتر
اصلی ترین عامل در بیان انبوه پروتئین نوترکیب، توالی پروموتر است که شرایط مناسب را برای رونویسی کارامد از ژن پایین دست خود و در صورت نیاز کنترل دقیق بیان را نیز در سطح نسخه برداری انجام پذیر می نماید پروموتر آغاز کننده رونویسی می باشد و ۱۰۰-۱۰ نوکلئوتید فرادست جایگاه اتصال ریبوزوم قرار دارد (۲۰۸).

۲-۳۲-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno)

این توالی برای آغاز ترجمه و مکمل شدن با انتهای ۳` از RNA 16S ریبوزوم ضروری است و کارایی سیستم ترجمه بستگی به توالی صحیح آن یعنی۵’-TAAGGAGG-3’ دارد .

۲-۳۳-استراتژی بیان در سیستمpET

همان گونه که اشاره شد ناقل های pET یک خانواده از ناقل های بیانی هستند که پروموترهای فاژ T7 را برای تنظیم سنتز محصول ژن کلون شده بکار می برند. برای تامین RNA پلیمراز فاژT7، سویه هایی از باکتریE.coli ساخته شده اند که دارای ژن ۱ فاژ۱ واقع در فرودست پروموتر Lac می باشند. در نتیجهRNA پلیمراز فاژ فقط با القاء IPTG سنتز می شود. سپس RNA T7 پلی مراز تازه سنتز شده، ژن بیگانه کلون شده در ناقل pET را رونویسی خواهد کرد (۲۱۵).

۲-۳۴-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+)

شکل ۲-۶٫ ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+) (209)

۲-۳۵-تولید پروتئین نوترکیب

برخی کاربردهای پروتئین نوترکیب عبارتند از: ایمنی زایی، مطالعات بیوشیمیایی، بررسی سه بعدی پروتئین‌ها و استفاده های درمانی و تشخیصی. تولید پروتئین نوترکیب نیاز به یک استراتژی هوشمندانه برای انتخاب سیستم بیانی، ناقل پلاسمیدی و پروتکل کلونینگ، بیان و تخلیص دارد (۲۱۶).